Простой способ выявления в биологических материалах хламидий, микоплазм (уреаплазм), трихомонад, гонококков, грибов и мн. др.

( Патент РФ № 2281472 )

---

Важно!

Настоящий материал является интеллектуальной собственностью автора. Его полная или фрагментарная публикация без согласия автора не допускается. Приведенный в материале способ диагностики защищен патентом РФ и не может быть использован в коммерческих целях без письменного согласия патентодержателя. Автор не возражает против частного (не коммерческого), а также научного использования публикуемых материалов, при условии соблюдения пользователями этических норм, принятых в науке и обществе. Автор не несет ответственности за возможные диагностические ошибки и расхождения результатов, полученных приводимым и каким-либо иным методом диагностики, и напоминает, что ни один диагностический метод не обладает абсолютной достоверностью. В случае первичного или вторичного использовании настоящих материалов в публикациях, просьба размещать в них ссылку на первоисточник (http://www.filix.ru/index.php?page=patent). Спасибо за понимание!

---

Предварительные замечания

Предлагаемый метод активно используется нами для целей диагностики с 1998 года. За это время он великолепно зарекомендовал себя как простой, универсальный, быстрый, дешёвый и надежный. Метод пригоден для скрининговой, первичной, мониторинговой и даже контрольной диагностики. Он может быть легко реализован в практически любом медучреждении и даже в домашних условиях. Для практической реализации метода не требуется ничего, кроме обычного микроскопа лабораторного (или даже учебного) класса, укомплектованного масляноиммерсионным объективом с увеличением 90-100^x и окуляром 7-10^x, а также небольшого количества реактивов и вспомогательных материалов. Публикация подготовлена по материалам заявки на изобретение и содержит избыточное количество вариаций метода. Для практических целей вполне достаточно фиксации материала 95%-спиртом и использования приблизительно 0.5% растворов красителей на водопроводной воде. Следует избегать смешивания красителей между собой, т.к. в результате их взаимодействия образуется малорастворимый аддукт, осаждающий их из раствора, а кроме того, несколько ухудшающий качество окраски. Следует также избегать попадания в растворы красителей посторонних веществ и спирта: зафиксированные спиртом мазки должны быть тщательно высушены (полезно также перед погружением в первый раствор сполоснуть стекло чистой водой). Не рекомендуется использование нефиксированных мазков ввиду возможного смыва части материала и быстрого загрязнения рабочих растворов. Методы отбора мазков подробно описаны здесь. В некоторых случаях, когда цитопаразитарные инфекции образуют массивные глубокие очаги (например, при аденоме простаты) выявить возбудителя в мазке удается не всегда. Это связано с существованием у цитопаразитов т.н. "чувства кворума" - механизма самоограничения общей численности паразита в организме-хозяине. Для обнаружения возбудителя в таких случаях могут быть применены провоцирующие и рассасывающие средства (предпочтительно - гомеопатические). Однако и этих мер может оказаться не достаточно. К счастью, такие случаи относительно редки, причем, их практически всегда удается распознать по характерной симптоматике (см. также).
Временное исчезновение цитопаразитов со слизистых возможно также после употребелния антибиотиков и некоторых противовоспалительных средств, например, салицилатов. Этот период может иметь протяженность от ненскольких дней до нескольких месяцев - в зависимости от дозы яда и скорости его выведения из организма. При длительном употребелнии подобых лекарственных средств также может наблюдаться уход инфекции с периферии с формированием (укрупнением) глубоких очагов.
Описываемый ниже метод диагностики был изучен в различных модификациях, при которых варьировались методы фиксации материала, концентрации красителей, растворители для красителей, продолжительность прокрашивания, pH растворов, методы просушки готовых мазков и некоторые другие параметры. Во всех случаях в пределах заявленных диапазонов результаты оказывались сопоставимыми, и редко можно было отдать предпочтение какой-либо из модификаций. Ниже приводятся примеры применимости метода, снабженные микрофотографиями в качестве иллюстраций. Конкретные прописи приведены только для препаратов крови, а также хламидий и микоплазм, т.к. метод особенно интересен для диагностики именно этих труднодиагностируемых патогенов. Однако те же самые методики могут быть использованы и для других приведенных здесь объектов, окраска которых производилась методом, описанным в примере Chl.1.
Автор готов ответить на любые вопросы, касающиеся применимости этого метода. И будет признателен его пользователям, которые предоставят ему результаты своих наблюдений.

Обозначения красителей, используемые в тексте:
БЖ – бриллиантовый желтый – динатриевая соль 4,4’-бис-(4-оксифенилазо)-стильбен-2,2’-дисульфоновой кислоты.
МС – метиленовый синий – 3,7-бис-диметиламинофеназатионийхлорид.

Форменные элементы тканей

Метод позволяет осуществлять дифференциальную окраску многих тканей растительного и животного происхождения. При этом, ядерный хроматин клеток окрашиваются в насыщенные тона от розового до темно-коричневого, а мембраны, в зависимости от вида клеток и их целостности, окрашены в светлые оттенки синего, розового, желтого, зеленого или серого тонов, но при этом контуры клеток получаются отчетливыми. Кроме этих элементов, иногда могут быть обнаружены ядрышки, глыбки хроматина и элементы цитоплазматической структуры. Хорошо прокрашиваются соматические клетки, форменные элементы крови, сперматозоиды, апоптотические фрагменты.

Форменные элементы крови

Метод позволяет распознавать по структуре, оттенкам и характеру зернистости форменные элементы крови, поэтому после дополнительных исследований и оптимизации, может служить дополнением или заменой существующим методам общего анализа крови.

Пример Sng.1
На предметном стекле делают тонкий мазок из свежезабранной крови, подсушивают на воздухе до полного высыхания и фиксируют погружением в метанол в течение 1-3 минут (допускается передержка). Извлекают из фиксатора и дают мазку подсохнуть на воздухе.
Погружают мазок в 0.1% р-р БЖ в водопроводной воде, выдерживают около минуты (допускается передержка). Извлекают. Дают красителю стечь. Осторожно промывают водопроводной водой до прекращения окрашивания стекающих капель.
На поверхность мазка наслаивают р-р МС, полученный смешением 3 об. ч. насыщенного этанольного р-ра МС и 10 об. ч. 0.01% водного р-ра гидроксида калия (т.н. «щелочная синька Леффлера»), слегка покачивая стекло, выдерживают 1-3 минуты до равномерного окрашивания, контролируемого визуально. Декантируют раствор и промывают мазок водопроводной водой до прекращения стекания окрашенных капель.
Оставляют высыхать при комнатной температуре или подсушивают феном в токе слегка подогретого воздуха.
Для исследования форменных элементов микроскопируют под масляной иммерсией при общем увеличении микроскопа 900-1200^x. При правильной окраске эритроциты приобретают красновато-коричневый цвет, а клетки белой крови окрашиваются гетерохромно:

Пример Sng.2
На предметном стекле делают тонкий мазок из свежезабранной крови, подсушивают на воздухе до полного высыхания и фиксируют поливом этанола в течение 1-3 минут (допускается передержка). Дают фиксатору стечь и полностью испариться с поверхности.
Погружают мазок в 0.1% р-р БЖ в дистиллированной воде, выдерживают около минуты (допускается передержка). Извлекают. Дают красителю стечь. Осторожно промывают дистиллированной водой до прекращения окрашивания стекающих капель.
Погружают мазок в 1% р-р МС в дистиллированной воде, выдерживают около минуты (допускается передержка). Извлекают. Дают красителю стечь. Осторожно промывают дистиллированной водой до прекращения окрашивания стекающих капель.
Оставляют высыхать при комнатной температуре или подсушивают феном в токе слегка подогретого воздуха.
Для исследования форменных элементов микроскопируют под масляной иммерсией при общем увеличении микроскопа 900-1200^x. При правильной окраске мазка, фиксированного в этаноле, эритроциты приобретают зеленый цвет, оттенок которого может варьировать в зависимости от деталей прокраски, свежести крови и, возможно, наличия/отсутствия в ней консервантов:

Другие форменные элементы

Красители легко и быстро проникают сквозь клеточные мембраны, но при этом прочно фиксируются и на некоторых компонентах самих мембран, создавая тем самым мелкомозаичный контур клетки. Причем, мембраны клеток, сохранявших целостность на момент отбора мазка (а также поврежденных только в момент его обработки), имеют светло-серую или серовато-голубую окраску, в отличие от мембран клеток, подвергшихся апоптозу (естественному «запрограммированному» саморазрушению), которые окрашены в яркие желтые или зеленые тона, как проиллюстрировано ниже. Встречаются также более интенсивно окрашенные клетки, по-видимому, несущие на своей поверхности иммунные комплексы и/или очень мелкую микрофлору.
Кроме соматических клеток, метод позволяет также окрашивать сперматозоиды, и может быть применен для определения их концентрации и морфологии при исследовании спермы, а также для выявления сперматореи и примесей спермы в исследуемом материале.

Клетка переходного эпителия.	Апоптозированные клетки плоского эпителия.	Атипичные клетки в респираторном тракте при раке.	Нормальный сперматозоид.

Хламидии

Хламидии – род мелких патогенных бактерий, включающий в себя несколько видов. Особенностью жизненного цикла всех видов хламидий является размножение внутри эпителиальных клеток хозяина с образованием т.н. телец включения (ТВ) – особых вакуолей, внутри которых происходит процесс бинарного деления с образованием новых бактериальных клеток. Каждое ТВ может содержать от десятков до сотен бактерий, которые после созревания покидают инфицированную клетку, заражают другие клетки организма и дают начало новым ТВ. В зависимости от вида, штамма и других факторов, каждая инфицированная эпителиальная клетка может содержать от одного до нескольких десятков ТВ, которые либо ассоциированы с ядром (как у «классических» штаммов Chl.trachomatis), либо диффузно расположены в цитоплазме (Chl.pneumoniae, Chl.psittaci). Как правило, ТВ, отличаются от ядер инфицированных клеток размерами (ядра обычно крупнее) и окраской (последняя вариабельная). Диагностика C.pneumoniae и других видов с диффузно расположенными ТВ никаких сложностей не представляет. Диагностика C.trachomatis может потребовать определенных навыков и внимательности в случаях, когда ТВ слишком плотно прилегает к ядру клетки или мало отличается от него по окраске, как в иллюстрации к примеру Chl.1, где один из эпителиоцитов содержит такое включение. В таких случаях следует особое внимание уделять форме ядер, которая в норме должна быть округлой – без сильной вытянутости и выпячиваний. При наличии большого количества «деформированных» подобным образом ядер, следует заподозрить инфицирование материала C.trachomatis. Однако на практике такие затруднения встречаются редко.

Известные методы обнаружения хламидий микроскопией окрашенного мазка (например, метод Романовского-Гимзы) отличаются значительной продолжительностью и трудоемкостью, использованием ядовитых компонентов (азур, метанол) и нестабильностью качества окраски. Существующие методы, основанные на иммунофлуоресцентых (ПИФ) и генных методах (ПЦР) отличаются узкой специфичностью к видам, подвидам или сероварам хламидий и применяются, в основном, для выявления типичных форм Chl.trachomatis. Для Chl.pneumoniae и Chl.psittaci, а также нетипичных форм Chl.trachomatis удовлетворительных методов такого рода диагностики не разработано.
Настоящий способ позволяет уверенно обнаруживать ТВ (единичные хламидии неотличимы от другой кокковой флоры) в клетках хозяина независимо от видовой принадлежности хламидий (на микроснимках ТВ любых видов хламидий отмечены как «ТВ Chl.sp.»). Следует отметить, что, в отличие от существующих методов, основанных на выявлении единичных бактерий (элементарных телец), предполагающих травматическую процедуру взятия соскоба со слизистой, заявленный метод позволяет с успехом использовать для отбора материала простой мазок.

Пример Chl.1
Мазок, взятый ватным аппликатором из дистальной части уретры женщины, легкими точечными прикосновениями наносят на предметное стекло, подсушивают на воздухе, погружают для фиксации в кювету с 95% этанолом, извлекают через несколько секунд и дают этанолу испариться на воздухе.
Сухой зафиксированный мазок погружают в 0.5% р-р БЖ в водопроводной воде до равномерного желтого окрашивания, контролируемого визуально (здесь и в других примерах: обычно – 1-2 минуты, допускается сколь угодно длительная передержка). Извлекают. Дают красителю стечь. Промывают проточной водой до прекращения окрашивания стекающих капель.
Погружают без подсушивания (подсушивание допускается) в 0.5% раствор МС в водопроводной воде и выдерживают в нем до равномерного интенсивного окрашивания, контролируемого визуально (здесь и в других примерах: обычно – 2-4 минуты, допускается сколь угодно длительная передержка). Промывают проточной водой до прекращения стекания окрашенных капель. Высушивают на воздухе.
Микроскопируют с масляной иммерсией при общем увеличении микроскопа 900-1200^x (допускается меньшее увеличение и отсутствие иммерсии, однако это может затруднить работу).
ТВ хламидий выявляются внутри эпителиальных клеток в виде одиночных или множественных включений округлой или продолговатой формы, прилегающих к ядру или диффузно расположенных в цитоплазме, обычно имеющих отличную от ядра окраску и меньшие размеры.

Пример Chl.2
Мазок, взятый ватным аппликатором из дистальной части уретры женщины, легкими точечными прикосновениями наносят на предметное стекло, подсушивают до полного высыхания и фиксируют нагреванием на электроплитке с закрытой спиралью и регулируемой мощностью, нагретой до температуры 110°С в течение 5-10 минут. Дают охладиться.
Погружают в 1% р-р БЖ в дистиллированной воде, выдерживают до равномерного желтого окрашивания, контролируемого визуально. Извлекают. Дают красителю стечь. Промывают дистиллированной водой до прекращения окрашивания стекающих капель.
Погружают без подсушивания в 1% р-р МС в дистиллированной воде и выдерживают в нем до равномерного интенсивного окрашивания, контролируемого визуально (допускается передержка). Промывают дистиллированной водой до прекращения стекания окрашенных капель. Высушивают нагреванием на микроплитке. Подщелачивают для улучшения цветового контраста обработкой в течение нескольких секунд парами аммиака.
Микроскопируют под масляной иммерсией при общем увеличении микроскопа 900-1200^x.
Данная модификация не приводит к существенным различиям в микроморфологической картине мазка в сравнении с модификацией, описанной в примере Chl.1, но несколько изменяет оттенки и интенсивность окраски некоторых форменных элементов.

Пример Chl.3
Мазок, взятый ватным аппликатором из влагалища, легкими точечными прикосновениями наносят на предметное стекло, подсушивают до полного высыхания и фиксируют сухим ацетоном в течение 1 минуты (допускается передержка). Дают ацетону испариться.
Смешивают в равных объемах 1% р-р БЖ в дистиллированной воде и 4% р-р хлористоводородной кислоты. Краситель почти полностью выпадает из раствора в виде темного осадка. Тем не менее, мазок погружают в полученную смесь и выдерживают в ней 3 минуты. Извлекают. Дают красителю стечь. Промывают водопроводной водой до прекращения окрашивания стекающих капель.
Погружают без подсушивания в 1% р-р МС в водопроводной воде и выдерживают в нем до равномерного интенсивного окрашивания, контролируемого визуально (допускается передержка). Промывают водопроводной водой до прекращения стекания окрашенных капель. Высушивают нагреванием на микроплитке.
Микроскопируют под масляной иммерсией при общем увеличении микроскопа 900-1200^x.
Данная модификация не приводит к существенным различиям в микроморфологической картине мазка в сравнении с модификациями, описанными в примерах Chl.1-2.

Пример Chl.4
Мазок, взятый посредством прямой аппликации с губок уретры мужчины, завершившего курс лечения от хламидиоза, подсушивают (если требуется) до полного высыхания и фиксируют метанолом в течение 1 минуты (допускается передержка). Извлекают. Дают метанолу испариться с поверхности.
Погружают в насыщенный р-р БЖ в водопроводной воде до равномерного желтого окрашивания, контролируемого визуально (допускается передержка). Извлекают. Дают красителю стечь. Промывают водопроводной водой до прекращения окрашивания стекающих капель.
Погружают без подсушивания в насыщенный р-р МС, и выдерживают в нем до равномерного интенсивного окрашивания, контролируемого визуально. Промывают водопроводной водой до прекращения стекания окрашенных капель. Высушивают феном в токе горячего (90°C) воздуха.
Микроскопируют под масляной иммерсией при общем увеличении микроскопа 900-1200^x. Следы погибших телец включения в эпителиальных клетках обнаруживают в виде темных пятен с неровными краями.
Данная модификация не приводит к существенным различиям в микроморфологической картине мазка в сравнении с модификациями, описанными в примерах Chl.1-3.

Микоплазмы

Микоплазмы – семейство мелких патогенных бактерий, включающее в себя не менее 14 родов и множество видов. Некоторые из них являются паразитами клеточных мембран и патогенны для человека. Микоплазмы прочно удерживаются на клеточных мембранах инфицированных клеток, а размножаясь, или распространяются по их поверхности, часто переползая и на мембраны соседних клеток, или отпочковываются в межклеточную жидкость и разносятся вместе с ней. Для питания и размножения они используют вещества, содержащиеся в межклеточном пространстве и входящие в состав клеток, нарушая трофику тканей и межклеточные коммуникации. По внешнему виду колоний и характеру их распространения они очень напоминают грибы, что и отражено в названии семейства. Молодые клетки в основном округлые, содержат много нейтральных липидов и практически не окрашиваются красителями (кроме липофильных). Старые клетки могут быть сильно вытянуты, часто имеют не отпочковавшиеся ответвления дочерних клеток, образуют сетеподобные сплетения на поверхности клеток хозяина и более восприимчивые к окрашиванию. Свободные клетки бактерий очень мелки, полиморфны и обычными методами неотличимы от банальной микрофлоры.
Удобных и при этом надежных методов обнаружения микоплазм в биологическом материале не разработано (наилучшие результаты – выявляемость ок. 60% - дают методы с применением посева на специальные питательные среды, разработанные для Ureaplasma urealyticum и Mycolasma hominis). Для большинства видов микоплазм какие-либо методы диагностики вообще отсутствуют.
При окрашивании таким способом, старые клетки образуют на слабоокрашенной мембране хорошо различимую тонкую сеть тонких темных (возможно, вследствие осаждения на них антител) нитей (филаментная форма), а молодые – сферические неокрашенные везикулы (везикулярная форма), которые контрастированы филаментной сетью, образованной старыми клетками, собственной окраской мембраны и прочими окрашенными объектами на её поверхности.
Настоящий способ позволяет уверенно обнаруживать патогенные (паразитирующие на клеточных мембранах) микоплазмы в биологическом материале, но за редким исключением не позволяет установить их видовую принадлежность (замечено, что уреаплазмы образуют более мелкие и более однородные по размерам везикулярные формы и более интенсивно окрашенные филаментные). Однако по причине сходства патогенезов и методов лечения такая индивидуализация имеет второстепенное значение.

Пример Myc.1
Мазок, взятый посредством прямой аппликации с губок уретры мужчины, подсушивают (если нужно) на воздухе и далее поступают, как описано в примере Chl.2.
Эпителиальная клетка слева не инфицирована. Клетка справа – инфицирована уреаплазмами. На увеличенном фрагменте инфицированной эпителиальной клетки видны неокрашенные везикулы молодых уреаплазменных клеток.

 

 

 

 

Пример Myc.2
Мазок, взятый ватным аппликатором из влагалища, обрабатывают, как указано в примере Chl.1. Выявляют клетки с характерными везикулярными и фибриллярными включениями на мембранах (темные "тяжи", которые, по видимому, представляют собой более старые нитевидные клетки, покрытые окрашенными в темный цвет иммуннымми комплексами).

 

 

 

 

Пример Myc.3
Отпечаток препуция молодого кобеля с признаками уретрита, подсушивают на воздухе, фиксируют поливом 95% этанола, вновь подсушивают на воздухе, погружают в 0.01% раствор БЖ и выдерживают в нем до появления видимого окрашивания (допускается передержка). Окрашенный мазок промывают водопроводной водой и погружают в 0.01% раствор МС. Мазок по какой-либо причине оставляют в растворе на ночь (допускается извлечение мазка по достижение необходимой интенсивности окрашивания (через несколько минут); процесс контролируют визуально). Утром мазок извлекают из раствора, промывают водопроводной водой, сушат феном и убеждаются в том, что передержка не отразилась на качестве прокраски посредством микроскопирования при увеличении 900^x.
Эпителиальная клетка инфицирована микоплазмами и окружена лейкоцитами (для очагов хронического микоплазмоза человека лейкоцитоз не характерен).

Другие бактерии

Применяя методы, аналогичные вышеописанным, можно надежно диагностировать различных представителей патогенной и банальной микрофлоры человека, животных и других природных объектов, в том числе, инфектологически значимые, такие как диплококки (включая гонококки и менингококки), гарднереллы, бактероиды, клостридии, дифтерийную палочку, и мн. др. Бактерии, видовую принадлежность которых трудно определить визульно, обозначены символом «sp.», следующим за родовым наименованием (например, «Leptospira sp.»).

Вагинальная флора. Палочки Дёдерляйна (Lactobacillus sp.).	Вагинальная флора. Гарднереллы (Gardnerella vaginalis).	Условно патогенная микролора пресного водоема. Спирохеты (Leptospira sp.).
Стрептобациллы (Bacillus cereus) из зева.	Палочки неустановленной видовой принадлежности из культуральной среды.	Острый гастроэнтерит. Clostridium perfringens (?) в желудочном соке.
	Дифтерийные палочки (Corynebacterium diphtheriae) из зева при ОРЗ.	Гонококки в лейкоцитах и внеклеточно при гонорее.

Вирусы

Некоторые вирусы (в том числе, вирус герпеса и цитомегаловирус) могут быть обнаружены предлагаемым способом по характерным изменениям в ядрах и/или цитоплазме эпителиальных клеток. В небольшом количестве они выявляются даже в состоянии ремиссии. При манифестации вирусной инфекции численность зараженных клеток резко возрастает. Ниже приводятся типичные микроскопические картины мазков при вирусных инфекциях.

Тотальное поражение ядер лейкоцитов при ОРВИ.	Герпесвирусная инфекция в ядрах эпителиоцитов.	Цитомегаловирусная инфекция в ядре эпителиоцита.	Эпителиоцит, поражённый коронавирусом при COVID-19. "Лист клевера" в ядре.

Простейшие

При любых модификациях метода простейшие прокрашиваются так же легко, как и форменные элементы тканей человека и животных:

Трихомонады из уретры.	Амеба из аквариума.	Флагеллята из аквариума.

Грибы

Многие грибы могут быть легко и полихромно прокрашены предлагаемым методом. Для целей дополнительной дифференциации грибов от иной микрофлоры, допустим предварительный щелочной гидролиз образца, к которому грибы, в отличие от большинства бактериальных и эукариотических клеток, устойчивы.

Конидии и обрывки мицелия грибов на фоне палочек Дёдерляйна при «молочнице».	Конидии и конидиеносцы пеницилла (Penicillum sp.) из зеленой хлебной плесени.
Конидии и конидиеносцы гриба неустановленного вида из чёрной потолочной плесени.	Microsporum canis с препуция ребенка.

В.Дворянчиков. Москва, 25 марта 2006 г.
e-mail: doctor@filix.ru
© Все права защищены.